贝博官网下载:文献详解丨这篇单细胞联合空转分析的文章小白必看!
发布时间:2022-09-29 03:16:15 来源:贝博球赛 作者:贝博的网站 阅读[18]

  编者按:本文简直可以作为单细胞联合空转分析入门的必看文章,分析方法分析思路都很简单,文章亮点就是有空转的数据作为单细胞数据分析结果的验证及补充,就是这样简单粗暴但有效!文章结合scRNA-seq和空间转录组分析结果,构建了间质性膀胱炎(IC)膀胱组织免疫细胞图谱,并发现几乎所有的免疫亚群都集中在IC膀胱的尿路上皮区或靠近成纤维细胞,而在对照膀胱的尿路上皮细胞和平滑肌细胞周围发现了免疫亚群。这些发现描绘了IC的免疫景观,并可能为IC的病理生理学提供有价值的见解。

  间质性膀胱炎(IC)是一种病因和病理生理尚不清楚的严重衰弱的慢性疾病,诊断困难,治疗具有挑战性。为了探讨免疫在IC膀胱中的作用,了解IC进展的分子机制,为治疗寻找更有效的靶点,作者采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组技术(ST)描绘了IC的“免疫景观”。

  首先通过scRNA-Seq结合CyTOF对女性IC患者免疫细胞(仅使用CD45+单细胞)进行了全面的表型和功能研究。然后,通过多峰交叉分析(MIA)将scRNA-Seq得到的免疫图谱与ST的结果进行整合,揭示IC患者膀胱的免疫状况。

  为了探究间质性膀胱炎(IC)的免疫环境,作者对15名IC患者和9名对照的膀胱组织进行CD45+免疫单细胞分离并测序。质控后对92,029个高质量的CD45+免疫细胞进行了进一步分析。通过细胞群鉴定共确定了22个免疫细胞亚群。细胞群占比分析发现,与对照组相比,IC患者组的CD4+Tcm细胞,Tregs细胞、活化B细胞和中性粒细胞等细胞亚群细胞占比显著增加,而CD8+效应T细胞、Th17细胞和巨噬细胞等显著减少。分别对Tregs和Th17细胞的差异基因(DEGs)进行功能富集分析发现,Tregs的DEGs主要集中在mRNA的分解代谢过程、病毒受体和局部黏附,而Th17细胞的DEGs主要集中在经典的炎症信号通路中。

  作者通过伪时间分析描绘了从CD14+巨噬细胞到M2巨噬细胞的分化轨迹。在分化过程中,促炎症基因(IL-1β、S100A8和NLRP3)在CD14+巨噬细胞中表达上调,但随着时间的推移逐渐下调。同时,吞噬基因和调节受体(CD163、FOLR2、STAB1、C1QA和MSR1)在M2巨噬细胞中逐渐上调。与对照组相比,炎症CD14+巨噬细胞的功能与炎症产生有关,M2巨噬细胞的DEGs主要集中在自身免疫性疾病中。巨噬细胞极化和M1/M2平衡在抗菌防御、哮喘和过敏、纤维化、伤口愈合和自身免疫中发挥重要作用。为了验证两种不同巨噬细胞的存在,作者进行了CD68、S100A8和CD163的免疫荧光染色。细胞间互作分析发现M2巨噬细胞、炎性CD14+巨噬细胞和常规树突状细胞与其他免疫细胞的互作关系最强。此外,新发现的趋化因子CCL5在几乎所有细胞类型中都上调。酶联免疫吸附试验证实了尿中CCL5的高水平,但在血液中没有,表明CCL5是一种潜在的IC的尿液生物标志物。

  接下来,作者利用CyTOF探究IC患者膀胱内的免疫亚群,并验证scRNA-seq结果。捕获CD45+免疫细胞进行CyTOF分析,根据细胞群典型标志物,鉴定出不同的细胞亚群,包括CD4+T细胞(CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)、B细胞(CD19)、巨噬细胞(CD68)、DC(CD11c)、肥大细胞(KIT)和活化细胞(HLA-DR),推测的细胞类型与scRNA-seq结果一致。重要的是,主要细胞比例的变化与scRNA-seq的结果一致。结合scRNA-seq分析结果,这些数据帮助验证和构建了IC膀胱中的免疫细胞图谱。

  作者分别对IC患者(n=3)和对照组(n=3)的6例膀胱组织进行空间转录组(ST)分析。经H&E染色和成像后,观察不同的组织学特征。质控后进行降维并通过T-SNE可视化以构建ST图。分析结果检测到平滑肌细胞、尿路上皮细胞、肌成纤维细胞、间质细胞和肥大细胞的标记基因。

  由ST图谱可知,纤维化基因(FN1, TGF-β1, COL1A1 and COL3A1)在IC患者膀胱组织的不同类型的细胞中高度表达,而在对照组的细胞中低表达,潜在地表明IC患者膀胱结构可能导致严重的纤维化。为了准确定位免疫细胞在IC膀胱中的位置以及揭示免疫细胞在IC和对照膀胱组织中的分布差异,应用多模式交叉分析(MIA)来注释细胞的跨结构定位。结构发现几乎所有的免疫亚群,如巨噬细胞、Tregs、浆细胞等都在IC膀胱的尿路上皮区或靠近成纤维细胞的位置,而在对照组中,它们主要在膀胱的尿路上皮细胞和平滑肌细胞周围。值得注意的是,在对照膀胱的尿路上皮区只发现了一半的免疫细胞亚群。

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