贝博官网下载:Western Blot 实验常见问题解析汇总
发布时间:2022-08-06 02:53:11
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产品简介:  WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象,经过SDS-PAGE分离蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以
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  WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象,经过SDS-PAGE分离蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的一抗起免疫反应,再与酶或同位素标记的二抗起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

  WB实验步骤较多,耗时均较长,且每步都影响最终的结果表现。我们将常见问题总结归纳为5大类,见表4-1。下面将对各问题进行分类总结,并对出现该现象的原因进行分析,给出相应的解决办法。

  条带或位置异常(微笑条带;皱眉条带;条带变形;哑铃条带;条带位置异常;条带粘连)

  其它问题(目标条带是空白,周围有背景;条带中间或周围出现白影;非均一性背景)

  WB结果中常出现白板或者条带无信号响应现象,如图4-1。我们针对出现该现象可能的原因主要从抗体,抗原,实验操作和缓冲液几方面进行分析。

  WB中所用到抗体包括一抗和二抗,在该问题上,两个抗体方面可能存在的原因以及相对应的解决方法,归纳总结在表4-2中。

  降低一抗稀释度;使用效价高的一抗;延长抗体孵育时间;膜充分浸润在液体中。

  每条泳道上样量不低于 20~30 ug, 使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照

  实验操作规范对于实验结果也至关重要,且需要重复摸索。无条带出现可能是目标蛋白未从胶转移至膜上或者洗膜过度,具体分析见表4-4。

  使用丽春红S染膜或使用考马斯亮蓝染胶检测转膜效果;检查转膜操作是否正确;优化电转条件;使用两张膜叠加载一起,防止转膜过度,或者使用小孔径膜

  实验中用到多种缓冲液,缓冲液的选择和保存,以及选择合适的显色方式都很重要。无目标蛋白出现可能与缓冲液有关的原因和解决方法见表4-5。

  WB结果中可能出现有目标蛋白条带,但是目标条带在膜上颜色较浅,如图4-3。该现象原因与4.1中无目标条带较为相似,可能导致该现象的原因我们也从4个方面进行分析,并给出相应的解决方法,具体分析见表4-6。

  使用丽春红S染膜或使用考马斯亮蓝染胶检测转膜效果;检查转膜操作是否正确;优化电转条件;使用两张膜叠加载一起,防止转膜过度,或使用小孔径膜

  条带或者位置异常是指条带形状异常和条带在膜上与理论位置不一致。条带形状异常常与电泳问题有关,SDS-PAGE电泳的质量至关重要。条带位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰,蛋白出现降解有关。下面就可能出现的各个问题结合实际案例详细讨论。

  电泳条带或整体出现 “︶ ”形状,如图4-4和4-5,可能原因主要包括两方面。一是电泳速度过快,可通过减少电压等减慢电泳速度。二是电泳温度过高,使得胶变形,可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。

  与微笑状条带相反,条带成现“︵”皱眉状,可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。可通过调整装置来避免该问题。如图4-6。

  WB结果中其它条带均正常,某条条带出现变形,如图4-7所示,出现该现象可能的原因是SDS-PAGE胶中有气泡或者不溶性颗粒。我们在配胶过程中要小心,使用无杂质的液体。

  结果中出现条带呈现哑铃状,如图4-8,该现象可能有两个原因导致。一是由于配置胶有问题,胶凝固后不均一,可通过重新配置胶,确保胶质量无问题来避免该现象出现。二是样品可能含有过多杂质,我们在样品使用前对其进行离心,以去除过多杂质。

  条带粘连是不同孔目标条带连在一起,中间无间隔,如图4-9所示。出现该现象的原因可能是上样量太多,或者是制胶问题,分离胶和浓缩胶之间有间隙,样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。

  分子条带大小,即条带位置异常,主要包括三种情况。第一种是出现高于目标蛋白较多的条带,如图4-10,该现象可能是由于蛋白未充分变性,导致蛋白形成二聚体或者多聚体。为避免该现象,可在实验之前加入新配的DTT或-ME,重新加热使得蛋白充分变性或者直接使用新的蛋白样本。第二种是出现略高于目标蛋白的条带,如图4-11,该现象可能是由于蛋白被修饰,如糖基化/磷酸化等,可导致分子量增加。解决方法是尝试使用酶去除可能的蛋白修饰。第三种是出现比目标蛋白略低的条带,如图4-12,该现象可能是由于蛋白翻译后剪切或者降解。在样品准备时候要在冰上操作或者是加入更过蛋白酶抑制剂,以防止蛋白降解。

  高背景是WB中常出现的问题,本文将高背景分为两类讨论,包括均一性高背景和斑点或发泡式或闪烁式非均一性高背景。下面针对两种情况均从抗体,实验操作和缓冲液方面进行分析讨论,并给出相应的解决方法,以减少背景,得到漂亮真实可靠的WB结果。

  均一性高背景在实验中常常出现,如图4-13,可能导致该现象的原因较多,均总结于表4-7中,并给出相应的解决方法。

  适当增加洗膜时间和次数;确保在充分震荡的条件下孵育膜,并且抗体充分覆盖膜表面

  出现非均一性高背景结果的原因与均一性背景有很多相似之处,也存在差别,如蛋白聚体的影响,非均一性高背景案例图如图4-14所示,可能原因见表4-8。

  使用干净镊子并戴手套操作;使用足够液体,膜始终保持湿润;孵育时使用脱色摇床;避免膜重叠,相互覆盖

  非特异性条带是指除目标蛋白以外的条带,杂带较多影响结果判断,且结果不可靠。下面我们结合实际案例对其可能原因进行分析,并找出相对应的解决方法,见表4-9。

  反白现象是蛋白条带中间空白,而周围背景正常,如图4-18所示。该现象可能原因是一抗浓度过高,二抗上HRP催化活力太强,同时显色底物处于临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白。可降低一抗和二抗浓度,或者更换底物来避免该现象。

  条带中间白圈(如图4-19)可能是由于电转中膜和胶之间存在气泡。在转膜过程中要尽量去除气泡,使膜,滤纸和胶紧密结合。同时,抗体孵育的过程中,保持膜的充分浸润。

  WB因结果直观易分析为蛋白研究中最常用的方法之一,但也因为其步骤繁杂结果变幻莫测成为很多新手的梦魇。相信看完本文的小伙伴一定会有所感悟,把握好基本原则:先做出条带,再优化结果。好看的结果千篇一律,有趣的条带五花八门,且把它们看作是枯燥科研中的小点缀吧~

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